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拉里·戴利（本·斯蒂勒饰）在第一集中，本-斯蒂勒饰演一名自然历史博物馆新上任的夜间警卫，他来担任这个职务之后，发现了一连串的怪事，博物馆的夜晚一片混乱，每样展品都活了过来、并向着他威胁过来…，他得在里头挣扎求存。《博物馆奇妙夜2》中，赖瑞则遇到了全新的情况。他这次已经是个事业有成的发明家，名利双收，但他总是有分失落感，似乎生命中某个重要的东西不见了。但很快地，他就接到来自史密森尼的讯息，再次地为他的人生带来动荡，那关于那段之前建立起的友谊的深厚，也提醒了他那段狂野精彩的日子。
爱蜜莉亚·埃尔哈特（艾米·亚当斯饰）很少女性能够像爱蜜莉亚埃尔哈特这样演绎冒险精神，她是一名飞行员，更是一名先驱者，以充满个人风格的单身飞行，改变了过往的飞行模式，更影响了之后几个世代的女性。爱蜜莉亚埃尔哈特以其聪明、机智、独立，以及大胆的飞行技巧闻名。当爱蜜莉亚埃尔哈特成功成为第一名横越大西洋的女性飞行员，由于她的创纪录生涯及长相都很类似另一先锋及美国英雄林白，因此有人腻称她为「林蒂女士」 (Lady Lindy)，当时她的知名度与受欢迎攀升到最高点，但却在1937年消失于太平洋，但并不损举世对其崇拜与热爱，…而她在史密森尼里，也有这样的地位。爱蜜莉亚·埃尔哈特对赖瑞有着更多的意义，因为在史密森尼的这个特别的晚上，她令他心动了。
卡曼拉（汉克·阿扎利亚饰）古埃及法老，妄图统治世界。他曾经被拒绝登上王位，现在能有再一次的机会成为世界之王，他再高兴不过了。他将要施展最残忍的手段，以报复在过去的日子里，这世界对他之所有不公不义。他又自大又邪恶，总是把话讲得很满。
伊凡雷帝（克里斯多弗·盖斯特饰）他是个非常令人讨厌的家伙。精神上有点毛病、老是对着人大吼大叫的俄国佬。与卡彭、拿破仑一起为法老王卡曼拉服务。
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